LegioTyper – Schnellmesstechnik zum Nachweis von Legionellen

Warum müssen Legionellen gemessen werden

Legionellen sind gramnegative, nicht sporenbildende, fakultativ aerobe Bakterien der Familie der Legionellaceae mit weltweit etwa 50 bekannten Legionellenarten und ca. 70 verschiedenen Serogruppen. Von diesen gelten alle als potentiell humanpathogen. Eine Gefahr für die menschliche Gesundheit ist das Einatmen dieser Keime, da sie eine Lungenentzündung mit Todesfolge verursachen können. Als hochinfektiös wird die Spezies Legionella pneumophila eingestuft, welche 90 % der bekannten Fälle an Legionellose auslösen. Von den 15 bekannten Serogruppen der Legionella pneumophila gilt Serogruppe 1 als hochpathogen, da von ihr 80 % der Legionellose-Infektionen ausgehen.

Wenn in einer technischen Anlage ein Flüssigkeitsstrom mit einem Gasstrom in Kontakt gebracht wird, können sich Legionellen-haltige Aerosole bilden. Verdunstungskühlanlagen, Kühltürme oder Nassabscheider scheiden partikelförmige Verunreinigungen ab. Sind die Legionellen im Prozesswasser, können Legionellen-haltige Aerosole in die Umwelt emittiert werden, wenn die Anlage nicht sachgemäß betrieben wird. In Deutschland traten Legionellen-assoziierte Ausbrüche gehäuft auf, wie zum Beispiel in Ulm (2010), Warstein (2013), Jülich (2014) und Bremen (2015/2016). Als Ausbruchsquelle wurde jeweils eine Verdunstungskühlanlage identifiziert, Grund war eine hohe Belastung an Legionella pneumophila. Als Reaktion darauf entstanden in den letzten Jahren folgende VDI-Richtlinien:

· VDI 4250 – Blatt 2: Umweltmedizinische Bewertung von Bioaerosol-Immissionen – Risikobeurteilung von legionellenhaltigen Aerosolen

· VDI 2047 – Blatt 2 und 3: Sicherstellung des hygienischen Betriebs von Verdunstungsanlagen und Kühltürmen

Die daraus resultierende 42. Bundesimmissionsschutzverordnung bezieht sich auf die VDI-Richtlinien und regelt bundesweit die Inbetriebnahme, das Betreiben und die Instandhaltung von Verdunstungskühlanlagen und Kühltürmen.

Wie werden Legionellen in der Routine bestimmt?

Die von der ISO 11731 und DIN EN ISO 11731-2 vorgeschriebene Methode zur Detektion von Legionellen ist das Kulturverfahren, welches jedoch erst nach ca. 10 Tagen Inkubation positive Ergebnisse liefert und lediglich Auskunft über das Vorhandensein von Legionella spp. gibt. Prozesswasser aus Verdunstungskühlanlagen, Kühltürmen und Nassabscheidern kann nicht mit Trinkwasser verglichen werden, weswegen das Umweltbundesamt eine Empfehlung veröffentlicht hat (Stand 2.6.2017), welche die Probenahme und den Nachweis von Legionellen genau definieren. Das Überwachsen durch andere schneller wachsende Keime oder auch die Anwesenheit von lebenden aber nicht kultivierbaren Legionellen führt häufig zu falsch negativen Befunden. Auch die Quantifizierung ist mit hohen Fehlern behaftet. Im Ausbruchsfall stehen die Betreiber und die Behörden unter Zeitdruck. Entsprechend kann laut UBA-Empfehlung der Zeitpunkt der ersten Ablesung auf den dritten Tag nach Probenahme gelegt werden um ggf. früher Hinweise auf hohe Legionellenkonzentrationen, insbesondere von Legionella pneumophila, zu bekommen. Außerdem sind, laut UBA-Empfehlung, im Ausbruchsfall zum schnellen Screening in Anlagen auf das Vorhandensein von Legionellen auch zusätzlich zur Kultur andere, schnellere Nachweisverfahren (z.B. qPCR) sinnvoll. Dieser Hinweis eröffnet die Möglichkeit, Schnellmesstechniken zum Nachweis von Legionellen anzuwenden. Neben der Verbesserung des Handelns im Ausbruchsfall können aber auch Betreiber, welche die hygienische Beschaffenheit ihrer Verdunstungskühlanlagen genau kennen müssen, zukünftig Schnellmesstechniken einsetzen. Zum Beispiel sollte die Wirksamkeit der Sanierungsmaßnahmen schnellst möglich Ergebnisse liefern, um die Anlage wieder in Betrieb nehmen zu können.

Schnellere Risikobewertung bei Legionellenexposition

Der Goldstandard zum Nachweis von Legionellen beruht auf der selektiven Vermehrung in einem definierten Nährmedium auf einer Agarplatte. Innerhalb von 10 Tagen bilden sich Kolonien, welche per Auge gezählt werden. Im Anschluss können einzelne Kolonien mit einem Antikörpertest untersucht werden. Hierbei wird festgestellt, ob Legionella pneumophila gewachsen ist und es kann zwischen Serogruppe 1 und 2-12 unterschieden werden.  Eine kulturunabhängige Serotypisierung von Legionella pneumophila für Wasser-, Luft- und Urinproben kann Ausbruchsherde hingegen zügiger identifizieren. Schnellmesstechniken zum Nachweis von Legionellen beruhen auf Antikörper- oder DNA-basierten Nachweismethoden ohne vorgeschaltete Kultivierung, wodurch eine Bestimmung von Legionellen innerhalb weniger Stunden Legionellen möglich ist. In dem vom BMBF geförderten Projekt „LegioTyper“ (www.legiotyper.de) wird dazu eine automatisierte Messplattform für die Legionellenanalytik entwickelt. Zukünftig sollen damit Ausbrüche von Legionella pneumophila schneller eingedämmt werden können, indem eine kulturunabhängige Serotypisierung den verantwortlichen Krankheitskeim über Antikörper-Mikroarrays sowohl in Wasser als auch in Luft oder Urinproben identifiziert. Zusätzlich können auf derselben Plattform über molekularbiologische Methoden auch lebende Legionella spp. und Legionella pneumophila nachgewiesen werden.

Antikörper-Mikroarrays auf dem LegioTyper

Der LegioTyper beruht auf der MCR-Technologie (MCR 3), an der Technischen Universität München bei Dr. Seidel / Prof. Nießner entwickelt wurde. Eine automatisierte Prozessierung von Mikroarray-basierten Immunoassays und integrierte Auslesung von Chemilumineszenz-Bildern ermöglicht es, hochparallele Analysen mit hoher Sensitivität und Selektivität durchzuführen. Im Projekt LegioTyper wurden erstmals kostengünstige Mikroarray-Einwegchips aus Kunststofffolien eingesetzt, welche die gleichen Eigenschaften wie kommerzielle Glaschips haben. Auf dem Mikroarray-Chip sind Fängerantikörper immobilisiert, welche einzelne Sero- und Subgruppen von Legionella pneumophila binden können. Die Fängerantikörper erkennen selektiv die Lipopolysaccharid-haltige Zellwand von Legionella pneumophila, welche für verschiedene Serogruppen und Subtypen unterschiedliche, signifikante Zuckersequenzen enthalten. Mit Hilfe von biotinylierten Detektionsantikörpern und nachfolgender Markierung mit dem Reagenz Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin können Chemilumineszenz-Bilder aufgenommen werden, wenn der Mikroarray-Flusszelle Luminol und Wasserstoffperoxid zugegeben wird. Die Aufnahme der Chemilumineszenz-Reaktion erfolgt mit einer hochempfindlichen CCD-Kamera. Auf Grund des heterogenen Assayprinzips und einer optimierten Oberflächenbehandlung des Mikroarray-Chips können auch komplexe Matrices, wie z.B. Urin oder Prozesswasser, verwendet werden, ohne störende Hintergrundsignale zu erhalten. Somit wird ausschließlich der Analyt durch die immobilisierten spezifischen Antikörper detektiert. Eine räumlich definierte Anordnung von 23 Fängerantikörpern auf einem Mikroarray-Chip ermöglicht einen kompletten Nachweis in 40 min. Im Projekt konnte gezeigt werden, dass sich das Schnellmesssystem zum Nachweis von Legionella pneumophila Serogruppe 1-14 in Urin-, Wasser-, und Aerosolproben eignet. Für Serogruppe 1 ist sogar die Identifikation der hochinfektiösen Ausbruchskeime/Subgruppen, wie zum Beispiel Legionella pneumophila Serogruppe 1, Subtyp Philadelphia möglich.

Um die Konzentrationen realer Wasserproben in den Konzentrationsbereich einer Mikroarray-Immunoassay-Messung zu bringen, werden die Legionellen vor Verwendung mittels monolithischer Adsorptions-Filtration und zentrifugaler Ultrafiltration aus einer großen Wassermenge (10 L) in ein geringeres Volumen (1 mL) überführt. Urinproben können direkt ohne Vorbehandlung gemessen werden.

Durch Vermessung von sowohl Wasser- und Luftproben als auch Urinproben von Legionellose-Patienten auf demselben Gerät (MCR 3) können Ausbruchsherde schneller identifiziert und nachgewiesen werden, was die Risikobewertung enorm verbessert. Maßnahmen zur Lageaufklärung und Schadensbewältigung können zukünftig schneller eingeleitet werden, als es bislang bei Ausbrüchen der Fall war.

DNA-Mikroarray auf dem LegioTyper

Am Lehrstuhl für Analytische Chemie und Wasserchemie wurde zudem projektunabhängig ein molekularbiologischer Nachweis von Legionella spp. und Legionella pneumophila auf dem Legiotyper-Messgerät etabliert. Dieser Nachweis erfolgt über eine isothermale Nukleinsäureamplifikation, genauer über die Rekombinase Polymerase Amplifikation auf DNA-Mikroarrays. Als Detektionsprinzip wird auch hier die Chemilumineszenz verwendet. Es wird hier das 16S RNA-Gen zum Nachweis von Legionella spp. und das mip-Gen zum Nachweis von Legionella pneumophila verwendet. Durch eine Vorbehandlung der Bakterienzellen mit dem photoreaktiven DNA-interkalierenden Farbstoff Propidiummonoazid konnte gezeigt werden, dass nur die lebenden Bakterien nachgewiesen werden. Dies ermöglicht es künftig die Wirkung von Bioziden in Verdunstungskühlanlagen zu überprüfen, da nur die lebenden Legionellen nachgewiesen werden. Parallel wird ohne Vorbehandlung mit Propidiummonoazid die generelle Anwesenheit/Menge von Legionellen quantifiziert.

Kurzer Ausblick

Im Projekt LegioTyper, welches aus den Projektpartern der Technischen Universität München, dem Bayrischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, der Technischen Universität Dresden und der GWK Präzisionstechnik GmbH besteht, steht in der letzten Projektphase nun die Feinjustage und weitere Testmessungen mit Realproben an. Des Weiteren wird der LegioTyper in den Maßnahmenkatalog für den Ausbruchsfall der Legionellose eingebettet, welcher über einen Ausschuss von VDI/DIN erarbeitet wird.

Autoren des Artikels

M.Sc. Catharina Kober und PD Dr. Michael Seidel
Lehrstuhl für Analytische Chemie und Wasserchemie & Institut  für Wasserchemie und Chemische Balneologie der Technischen Universität München